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 銀離子對大腸埃-希桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌作用機理研究

中國清華大學材料工程和科學系         Q. L. Feng   J. wu   F. Z. Cui.

中國清華大學生物科學和生物工程系     G. Q. Chen

韓國Paichai 大學先進材料工程系        T. V. Kim.  J. O. Kim.

1999.4.30提交，2000.3.1修改，2000,3.9接受。

摘要：

為了了解銀離子對微生物抑制的機理，用硝酸銀對被稱作G-的大腸桿菌（Escherichia coli ）和G+的金黃色葡萄球菌（S.aureus）的兩種菌株進行處理。研究中使用了聯(lián)合電子顯微鏡和X—線微分析方法。

在經(jīng)過Ag+的作用后，大腸桿菌和金葡菌細胞發(fā)生了相同的形態(tài)學改變。細胞漿膜從細胞壁上分離開來，在細胞中央出現(xiàn)了明顯的電子—光區(qū)域，它包括了致密的DNA分子。有很多小的電子密度結節(jié)圍繞在細胞壁周圍或沉淀在細胞內(nèi)，X—線微分析檢測到電子密度結節(jié)和胞漿內(nèi)有銀和硫元素的存在。這揭示出銀的抗菌機理：Ag+的作用使DNA 失去它的復制能力并且導致蛋白質(zhì)的失活。金葡球菌的形態(tài)學改變較大腸桿菌輕微，意味著金葡球菌對銀離子的抑菌作用有抵抗作用。

關鍵詞：銀離子、抗菌機理、DNA分子、形態(tài)學改變、電子顯微鏡

引言

銀離子具有廣譜的、強大的抑菌作用已久為人知，銀的一些形態(tài)已被引入用來有效治療燒傷、嚴重的慢性骨髓炎、尿道感染和中心靜脈導管感染等疾病。

在我們以前的一項工作中，抗菌陶瓷已成功制造出來。那是以羥磷灰石(HA)為基材，加入硝酸銀后用濕化學過程完成的。它證明了羥磷灰石涂層中的植入材料用銀處理后，顯示出優(yōu)秀的抗菌作用。也有報告稱，把Ag + 放入有許多微小孔隙的HA涂層，可以作為生命活性物質(zhì)傳遞系統(tǒng)，可以緩慢釋放抗菌物質(zhì)。一些方案已被發(fā)展為解釋Ag +的抑菌效果。一般認為，重金屬通過與SH基的結合與蛋白質(zhì)起反應。這導致蛋白質(zhì)的失活。最近的微生物學和化學試驗揭示Ag +與巰基相互作用，在滅活細菌的過程中扮演了一個基本的角色，揭示大量的銀在有氧的多水的介質(zhì)中，催化了微生物的氧化過程導致它們完全毀滅。銀和過氧化氫共同作用影響大腸桿菌的生存。Ag和過氧化氫的聯(lián)合的毒性作用可能損壞了細胞的蛋白質(zhì)。銀離子的抗微生物機理仍沒有全部被了解。Ag+ 對細菌的作用可能很復雜。然而對形態(tài)和結構的直接觀察，可以對了解銀的抗菌效應和抑菌過程提供有用的信息。

材料和方法

（略）

結果

Ag+處理后的大腸桿菌形態(tài)學改變。

圖1 顯示正常的大腸桿菌內(nèi)部結構，清晰顯示細胞的電子密度在無外界環(huán)境的干擾時，細胞的正常狀態(tài)。DNA分子、電鏡下的電子-光物質(zhì) 如圖1（b）箭頭所示，隨意分布在細胞內(nèi)幾乎每個區(qū)域。

（圖2 ）顯示加入Ag+后，E.Coli細胞顯著的形態(tài)學改變。圖2(a)是對銀作用細胞的總的情況。圖2(b)-(f)是放大后的觀察。銀作用后，顯著的電子-光區(qū)域經(jīng)常出現(xiàn)在大腸埃-希菌的細胞中央圖2(a)箭頭所示。在電子-光區(qū)域的中央可以清楚地看到一些濃縮的物質(zhì)，就像互相絞在一起的線，如圖2(b)箭頭所示。

銀處理過的大腸桿菌細胞漿膜和胞壁之間，出現(xiàn)了一個大的裂隙如圖2(c)。相比較于圖1的正常胞漿膜，銀離子的作用使得胞漿膜和胞壁分離開來。

圖2(d)箭頭處可以清楚地看到電子密度的結節(jié)圍繞著細胞壁。這些結節(jié)也存在于細胞漿中圖2(a)-(f)。但是電子-光區(qū)域內(nèi)沒有電子密度結節(jié)。觀察到大量的電子密度結節(jié)圍繞在電子-光區(qū)域周圍，但卻不在這個區(qū)域內(nèi)，這很有意思。這可能說明電子-光區(qū)域有防止電子密度結節(jié)進入的功能。與之相對比，在控制樣本內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)電子密度結節(jié)。

然而，圖2(e) 中可見相互矛盾的現(xiàn)象。觀察到細胞是由大量彌漫的、大的電子密度結節(jié)組成，而無電子-光區(qū)域和濃縮的DNA分子。在這種細胞中，沒有細胞壁。這種細胞就像是一個包含電子密度結節(jié)和胞漿的區(qū)域，可能是銀作用過的細胞將要死亡的特征形態(tài)。相同的情況只出現(xiàn)在與銀有關的物質(zhì)中。

圖2(f)中看到在一些細胞中，細胞壁已被嚴重損壞了。在細胞內(nèi)，有很多結節(jié)圍繞著電子-光區(qū)域。對小的電子密度結節(jié)和電子-光區(qū)域外的胞漿進行X-線微分析，顯示大量的銀和硫，說明銀離子進入細胞并與包括硫在內(nèi)的一些元素結合。

討論：

用銀處理金葡菌和大腸桿菌后，發(fā)生了相同的現(xiàn)象，即：胞漿膜皺縮或從胞壁分離，在細胞中央出現(xiàn)電子-光區(qū)域，DNA分子位于這個區(qū)域的中央。在細胞內(nèi)可以檢測到銀離子。所有這些現(xiàn)象說明銀離子攻擊細菌的可能的機理，和Gram陽性菌和Gram陰性菌-抵御銀離子攻擊的防御系統(tǒng)是一樣的。

DNA是細胞內(nèi)最重要的遺傳信息，任何對—的損害都可導致機體的突變或死亡，自然情況下，細胞可以保護DNA分子免受侵害，電子-光區(qū)域如圖2(a)對DNA分子有這樣的保護功能。銀離子存在于電子密度結節(jié)內(nèi)（圖3(a)），而在電子-光區(qū)域內(nèi)幾乎沒有電子密度結節(jié)的現(xiàn)象，說明電子-光區(qū)域?qū)NA的保護功能。然而，直到現(xiàn)在，我們還不知道電子-光區(qū)域是如何形成的，并且在這區(qū)域內(nèi)，除了DNA分子外，其他主要成分是什么。

Nover等人報告說，細胞為對抗有害的熱刺激，會產(chǎn)生一些小分子蛋白質(zhì)，并且在細胞核的周圍聚集起來。雖然熱刺激與銀離子對細胞的影響不同，但這些都是外部環(huán)境對微生物的侵害。所以，當遭受銀離子攻擊后，細胞產(chǎn)生刺激蛋白，聚集在細胞核周圍保護DNA分子是可能的。如圖2(b)然而如果攻擊非常強烈，以致這種應激反應來不及有效發(fā)揮作用，電子-光區(qū)域或甚至是細胞壁就會毀壞，并且電子密度結節(jié)就會充滿細胞。如圖2(e)

現(xiàn)在知道DNA分子僅僅在放松的狀態(tài)下才能有效地進行復制，在濃縮狀態(tài)下，DNA分子就會失去這種復制能力，這已在目前的實驗中被證實了。把銀處理過的細胞移到新鮮的液態(tài)—培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，細胞不能生長和繁殖。這個實驗說明銀離子抗菌作用的機理可能是：DNA的濃縮狀態(tài)失去了復制的能力。

硫在EDAX譜中的存在支持銀離子抗菌作用的另一個機理：銀與蛋白質(zhì)上的巰基結合，使酶失活。巰基是酶有活性的一個重要基團。有報告說，重金屬通過與巰基結合使蛋白質(zhì)失活。另一方面，銀是一種可以使蛋白質(zhì)沉淀的重金屬。所以，銀進入細菌細胞，可以導致蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)沉淀?？紤]到這些，那么在電子-光區(qū)域外的電子密度結節(jié)應該是銀和蛋白質(zhì)沉淀物的復合物。

金葡菌形態(tài)改變較輕微，可能是由于它的結構特征。Gram+和Gram-菌細胞的細胞壁有顯著不同。很明顯，Gram+菌細胞壁的多肽比Gram-菌厚的多。金葡菌更厚的胞壁在保護細胞不讓銀離子進入胞漿方面，起了很大作用。

目前的研究，給出了抗微生物植入物實際應用的一些建議。只有當銀離子可以從植入物中釋放出來才有抗菌效果。釋放出的銀離子穿透細胞壁進入細胞，結果使得DNA分子成為濃縮狀態(tài)，同時與蛋白質(zhì)發(fā)生反應。所有這些導致微生物損害或死亡。見圖2

結論：

比較了銀離子對大腸桿菌和金葡菌的影響結果，我們發(fā)現(xiàn)：

1，  細胞內(nèi)電子-光區(qū)域中央DNA由自由狀態(tài)變成濃縮狀態(tài)。

2，  在細胞壁或電子-光區(qū)域周圍出現(xiàn)電子密度結節(jié)。

3，  X-線微分析顯示銀存在于電子密度結節(jié)、細胞漿和DNA分子中。

以上結果引出關于銀離子對大腸桿菌和金葡菌的抗菌機理的結論：

1， 銀離子有致細胞變性的作用，作為對抗這種作用的一種反應，DNA分子成為濃縮狀態(tài)并失去其復制能力

2， 銀離子與蛋白質(zhì)上的巰基相互作用，導致細菌蛋白質(zhì)的失活。