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銀離子對大腸埃-希桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌作用機(jī)理研究

中國清華大學(xué)材料工程和科學(xué)系         Q. L. Feng   J. wu   F. Z. Cui.

中國清華大學(xué)生物科學(xué)和生物工程系     G. Q. Chen

韓國Paichai 大學(xué)先進(jìn)材料工程系        T. V. Kim.  J. O. Kim.

1999.4.30提交，2000.3.1修改，2000,3.9接受。

摘要：

為了了解銀離子對微生物抑制的機(jī)理，用硝酸銀對被稱作G-的大腸桿菌（Escherichia coli ）和G+的金黃色葡萄球菌（S.aureus）的兩種菌株進(jìn)行處理。研究中使用了聯(lián)合電子顯微鏡和X—線微分析方法。

在經(jīng)過Ag+的作用后，大腸桿菌和金葡菌細(xì)胞發(fā)生了相同的形態(tài)學(xué)改變。細(xì)胞漿膜從細(xì)胞壁上分離開來，在細(xì)胞中央出現(xiàn)了明顯的電子—光區(qū)域，它包括了致密的 DNA分子。有很多小的電子密度結(jié)節(jié)圍繞在細(xì)胞壁周圍或沉淀在細(xì)胞內(nèi)，X—線微分析檢測到電子密度結(jié)節(jié)和胞漿內(nèi)有銀和硫元素的存在。這揭示出銀的抗菌機(jī)理：Ag+的作用使DNA 失去它的復(fù)制能力并且導(dǎo)致蛋白質(zhì)的失活。金葡球菌的形態(tài)學(xué)改變較大腸桿菌輕微，意味著金葡球菌對銀離子的抑菌作用有抵抗作用。

關(guān)鍵詞：銀離子、抗菌機(jī)理、DNA分子、形態(tài)學(xué)改變、電子顯微鏡

引言

銀離子具有廣譜的、強(qiáng)大的抑菌作用已久為人知，銀的一些形態(tài)已被引入用來有效治療燒傷、嚴(yán)重的慢性骨髓炎、尿道感染和中心靜脈導(dǎo)管感染等疾病。

在我們以前的一項(xiàng)工作中，抗菌陶瓷已成功制造出來。那是以羥磷灰石(HA)為基材，加入硝酸銀后用濕化學(xué)過程完成的。它證明了羥磷灰石涂層中的植入材料用銀處理后，顯示出優(yōu)秀的抗菌作用。也有報告稱，把Ag + 放入有許多微小孔隙的HA涂層，可以作為生命活性物質(zhì)傳遞系統(tǒng)，可以緩慢釋放抗菌物質(zhì)。一些方案已被發(fā)展為解釋Ag +的抑菌效果。一般認(rèn)為，重金屬通過與SH基的結(jié)合與蛋白質(zhì)起反應(yīng)。這導(dǎo)致蛋白質(zhì)的失活。最近的微生物學(xué)和化學(xué)試驗(yàn)揭示Ag +與巰基相互作用，在滅活細(xì)菌的過程中扮演了一個基本的角色，揭示大量的銀在有氧的多水的介質(zhì)中，催化了微生物的氧化過程導(dǎo)致它們完全毀滅。銀和過氧化氫共同作用影響大腸桿菌的生存。Ag和過氧化氫的聯(lián)合的毒性作用可能損壞了細(xì)胞的蛋白質(zhì)。銀離子的抗微生物機(jī)理仍沒有全部被了解。Ag+ 對細(xì)菌的作用可能很復(fù)雜。然而對形態(tài)和結(jié)構(gòu)的直接觀察，可以對了解銀的抗菌效應(yīng)和抑菌過程提供有用的信息。

材料和方法

（略）

結(jié)果

Ag+處理后的大腸桿菌形態(tài)學(xué)改變。

圖1 顯示正常的大腸桿菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)，清晰顯示細(xì)胞的電子密度在無外界環(huán)境的干擾時，細(xì)胞的正常狀態(tài)。DNA分子、電鏡下的電子-光物質(zhì) 如圖1（b）箭頭所示，隨意分布在細(xì)胞內(nèi)幾乎每個區(qū)域。

顯示加入Ag+后，E.Coli細(xì)胞顯著的形態(tài)學(xué)改變。圖2(a)是對銀作用細(xì)胞的總的情況。圖2(b)-(f)是放大后的觀察。銀作用后，顯著的電子 -光區(qū)域經(jīng)常出現(xiàn)在大腸埃-希菌的細(xì)胞中央圖2(a)箭頭所示。在電子-光區(qū)域的中央可以清楚地看到一些濃縮的物質(zhì)，就像互相絞在一起的線，如圖2(b) 箭頭所示。

銀處理過的大腸桿菌細(xì)胞漿膜和胞壁之間，出現(xiàn)了一個大的裂隙如圖2(c)。相比較于圖1的正常胞漿膜，銀離子的作用使得胞漿膜和胞壁分離開來。

圖 2(d)箭頭處可以清楚地看到電子密度的結(jié)節(jié)圍繞著細(xì)胞壁。這些結(jié)節(jié)也存在于細(xì)胞漿中圖2(a)-(f)。但是電子-光區(qū)域內(nèi)沒有電子密度結(jié)節(jié)。觀察到大量的電子密度結(jié)節(jié)圍繞在電子-光區(qū)域周圍，但卻不在這個區(qū)域內(nèi)，這很有意思。這可能說明電子-光區(qū)域有防止電子密度結(jié)節(jié)進(jìn)入的功能。與之相對比，在控制樣本內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)電子密度結(jié)節(jié)。

然而，圖2(e) 中可見相互矛盾的現(xiàn)象。觀察到細(xì)胞是由大量彌漫的、大的電子密度結(jié)節(jié)組成，而無電子-光區(qū)域和濃縮的DNA分子。在這種細(xì)胞中，沒有細(xì)胞壁。這種細(xì)胞就像是一個包含電子密度結(jié)節(jié)和胞漿的區(qū)域，可能是銀作用過的細(xì)胞將要死亡的特征形態(tài)。相同的情況只出現(xiàn)在與銀有關(guān)的物質(zhì)中。

圖2(f)中看到在一些細(xì)胞中，細(xì)胞壁已被嚴(yán)重?fù)p壞了。在細(xì)胞內(nèi)，有很多結(jié)節(jié)圍繞著電子-光區(qū)域。對小的電子密度結(jié)節(jié)和電子-光區(qū)域外的胞漿進(jìn)行X-線微分析，顯示大量的銀和硫，說明銀離子進(jìn)入細(xì)胞并與包括硫在內(nèi)的一些元素結(jié)合。

討論：

用銀處理金葡菌和大腸桿菌后，發(fā)生了相同的現(xiàn)象，即：胞漿膜皺縮或從胞壁分離，在細(xì)胞中央出現(xiàn)電子-光區(qū)域，DNA分子位于這個區(qū)域的中央。在細(xì)胞內(nèi)可以檢測到銀離子。所有這些現(xiàn)象說明銀離子攻擊細(xì)菌的可能的機(jī)理，和Gram陽性菌和Gram陰性菌-抵御銀離子攻擊的防御系統(tǒng)是一樣的。

DNA 是細(xì)胞內(nèi)最重要的遺傳信息，任何對—的損害都可導(dǎo)致機(jī)體的突變或死亡，自然情況下，細(xì)胞可以保護(hù)DNA分子免受侵害，電子-光區(qū)域如圖2(a)對DNA分子有這樣的保護(hù)功能。銀離子存在于電子密度結(jié)節(jié)內(nèi)（圖3(a)），而在電子-光區(qū)域內(nèi)幾乎沒有電子密度結(jié)節(jié)的現(xiàn)象，說明電子-光區(qū)域?qū)NA的保護(hù)功能。然而，直到現(xiàn)在，我們還不知道電子-光區(qū)域是如何形成的，并且在這區(qū)域內(nèi)，除了DNA分子外，其他主要成分是什么。

Nover等人報告說，細(xì)胞為對抗有害的熱刺激，會產(chǎn)生一些小分子蛋白質(zhì)，并且在細(xì)胞核的周圍聚集起來。雖然熱刺激與銀離子對細(xì)胞的影響不同，但這些都是外部環(huán)境對微生物的侵害。所以，當(dāng)遭受銀離子攻擊后，細(xì)胞產(chǎn)生刺激蛋白，聚集在細(xì)胞核周圍保護(hù)DNA分子是可能的。如圖2(b)然而如果攻擊非常強(qiáng)烈，以致這種應(yīng)激反應(yīng)來不及有效發(fā)揮作用，電子-光區(qū)域或甚至是細(xì)胞壁就會毀壞，并且電子密度結(jié)節(jié)就會充滿細(xì)胞。如圖2(e)

現(xiàn)在知道DNA分子僅僅在放松的狀態(tài)下才能有效地進(jìn)行復(fù)制，在濃縮狀態(tài)下，DNA分子就會失去這種復(fù)制能力，這已在目前的實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)了。把銀處理過的細(xì)胞移到新鮮的液態(tài)—培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞不能生長和繁殖。這個實(shí)驗(yàn)說明銀離子抗菌作用的機(jī)理可能是：DNA的濃縮狀態(tài)失去了復(fù)制的能力。

硫在EDAX譜中的存在支持銀離子抗菌作用的另一個機(jī)理：銀與蛋白質(zhì)上的巰基結(jié)合，使酶失活。巰基是酶有活性的一個重要基團(tuán)。有報告說，重金屬通過與巰基結(jié)合使蛋白質(zhì)失活。另一方面，銀是一種可以使蛋白質(zhì)沉淀的重金屬。所以，銀進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)沉淀?？紤]到這些，那么在電子-光區(qū)域外的電子密度結(jié)節(jié)應(yīng)該是銀和蛋白質(zhì)沉淀物的復(fù)合物。

金葡菌形態(tài)改變較輕微，可能是由于它的結(jié)構(gòu)特征。Gram+和Gram-菌細(xì)胞的細(xì)胞壁有顯著不同。很明顯，Gram+菌細(xì)胞壁的多肽比Gram-菌厚的多。金葡菌更厚的胞壁在保護(hù)細(xì)胞不讓銀離子進(jìn)入胞漿方面，起了很大作用。

目前的研究，給出了抗微生物植入物實(shí)際應(yīng)用的一些建議。只有當(dāng)銀離子可以從植入物中釋放出來才有抗菌效果。釋放出的銀離子穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞，結(jié)果使得DNA分子成為濃縮狀態(tài)，同時與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。所有這些導(dǎo)致微生物損害或死亡。見圖2

結(jié)論：

比較了銀離子對大腸桿菌和金葡菌的影響結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)：

1，  細(xì)胞內(nèi)電子-光區(qū)域中央DNA由自由狀態(tài)變成濃縮狀態(tài)。

2，  在細(xì)胞壁或電子-光區(qū)域周圍出現(xiàn)電子密度結(jié)節(jié)。

3，  X-線微分析顯示銀存在于電子密度結(jié)節(jié)、細(xì)胞漿和DNA分子中。

以上結(jié)果引出關(guān)于銀離子對大腸桿菌和金葡菌的抗菌機(jī)理的結(jié)論：

1， 銀離子有致細(xì)胞變性的作用，作為對抗這種作用的一種反應(yīng)，DNA分子成為濃縮狀態(tài)并失去其復(fù)制能力

2， 銀離子與蛋白質(zhì)上的巰基相互作用，導(dǎo)致細(xì)菌蛋白質(zhì)的失活。